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酶活性抑制分析法(三)

2020-09-02 16:35:13 用户 周世红

(二)乙酸-β-萘酯-固蓝B盐显色法

此法利用底物水解产生的β-萘酚与固蓝B盐作用生成偶氮化合物而显色。

(三)乙酸羟基吲哚显色法

底物乙酸羟基吲哚水解产生吲哚酚,吲哚酚被氧化形成有色产物而显色。

(四)乙酸靛酯显色法

底物乙酸靛酯水解产生有色的产物靛酚蓝而显色。

(五)碘化硫代胆碱褪色法

底物碘化硫代乙酰胆碱水解生成碘化硫代胆碱,碘化硫代胆碱能使蓝色的2,6-二氯靛酚还原褪色。

(六)碘化硫代丁酰胆碱显色法

底物碘化硫代丁酰胆碱(BTCI)水解生成碘化硫代胆碱,碘化硫代胆碱与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色溶液。

在上述显色反应中,乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色法灵敏度不高,故很少使用。而以乙酸-β-萘酯-固蓝B盐、乙酸靛酯、吲哚乙酸酯及其衍生物为底物的显色法灵敏度高,适应性广,底物和显色剂较容易获得,因而被广泛应用。

在酶活性抑制法中,影响检测灵敏度的因素是多方面的,除底物的种类和显色反应类型外,酶的来源、酶与底物的配合、抑制剂的种类和性质不同,对农药的检测限、特异性和稳定性不同。有些农药在生物体外是较弱的酶抑制剂,但经过生物氧化可成为较强的酶抑制剂,如乐果+02→氧化乐果、对硫磷+02→对氧磷可显著提高对乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制活性。依据该原理,可以采用在体外对待测农药进行氧化处理等方法,使之成为较强的酶抑制剂,以提高对待测农药的检测灵敏度。常用的处理剂有冷的发烟硝酸、稀溴水、过氧化氢、过氧乙酸、溴代琥珀酰亚胺等,或采用紫外光照射处理。

六、酶活性抑制法中的样品制备

蔬菜、水果等新鲜农产品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是利用酶活性抑制法进行快速检测的主要对象,其目的主要是先对大批量样品进行现场快速筛选检测,对不合格样品再进行复检,对复检仍不合格的少量样品再用色谱法或色谱质谱联用法进行分析,以便减少实验室仪器分析的工作量,提高检测效率。酶活性抑制法中蔬菜水果样品的制备与仪器分析样品制备相比,方法比较简单。

(一)磷酸盐缓冲液提取法

磷酸盐缓冲液提取法依照国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测》(GB/T 5009.199—2003)进行。

1、叶菜类的磷酸盐缓冲液提取法:取去除泥土的待测样品(白菜、甘蓝、油菜、韭菜等)剪成1cm2的小块(韭菜剪成1cm长的小段),随机取小块或小段样品1g,放入,烧杯或提取瓶中,加入5mL提取缓冲液(15.0g Na2HPO4·12H2O和1.59g NaH2P04溶于500 mL蒸馏水,pH 7.5),振荡l~2 min。倒出提取液,静置3~5 min,用于丁酰胆碱酯酶分光光度法测定。或随机取小块或小段样品约5g,放入提取瓶中,加10mL缓冲液,振摇50次,静置2 min以上,用速测卡法测定。

2、果菜及水果类的磷酸盐缓冲液提取法:取待测样品(番茄、黄瓜、青椒、茄子、苹果、梨等)去除表面泥土,用取样器沿果菜表面处取约1cm厚的样品放人提取瓶中,加入提取缓冲液振荡l~2min。倒出提取液,静置3~5min后待测。对萝卜等根菜类样品,先去除表面泥土和须根,再按果菜类样品提取方法提取。

(二)有机溶剂提取法

有机溶剂提取法依照国家标准《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法》(GB/T 18630一2002)进行。

擦去蔬菜表面的泥水,将可食部分剪碎,取2g置10mL提取瓶中,加5mL丙酮浸泡5min,不断振摇,加0.2g碳酸钙(对番茄等酸性较强的样品可加0.3~O.4g)。如颜色较深,可加0.2g活性炭,摇匀,过滤。取1mL丙酮滤液于5mL烧杯中,吹干丙酮后加0.6mL 1/15m01/L pH 7.7的磷酸盐缓冲液溶解,加入0.2mL 0.5%(m/V)次氯酸钙水溶液摇匀,放置10 min进行氧化处理,再加入0.6mL 10%(m/V)亚硝酸钠水溶液摇匀,还原过量的氧化剂,处理液待测。

许多蔬菜(如葱、蒜、韭菜、芹菜、番茄、萝卜、茭白、蘑菇等)含有对酶活性有影响的次生代谢产物,容易使测定结果产生假阳性。叶绿素等色素也可能影响显色反应结果。处理这些样品时,可采取整体(株)蔬菜浸提或采用表面测定法。在制样中将样品切成1~2cm的小块,在确保农药提取效果的同时控制浸提时间,以减少色素等干扰物质的溶出。如样品浸提液出现浑浊,应适当增加样品的静置时间。

七、酶活性抑制分析的检测方法

(一)分光光度法

1、乙酰胆碱酯酶活性抑制分析的分光光度法:乙酰胆碱酯酶活性抑制法的分光光度法采用国家标准《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法-酶抑制法》(GB/T 18630 2002)。在上述有机溶剂(或磷酸盐缓冲液)提取并经氧化处理的溶液中,加入经色谱柱纯化的酶液O.2mL,摇匀后放置10min。加入2%(m/V)碘化硫代乙酰胆碱溶液0.2mL和O.04%(m/V)的2,6-二氯靛酚水溶液0.1mL混匀,37℃下反应5min,测吸光值A600(0D600),A600越大,表明农药残留量越高。A600<0.7为未检出,A600为O.7~0.9为可能检出但残留量较低,A600>0.9为检出。

参考资料:农药残留分析

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