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酶活性抑制分析法(二)

2020-09-02 17:51:49 用户 周世红

三、酶源的选择与酶的制备

酶的种类、酶的特异性、酶的活性和稳定性等是影响酶活性抑制法测定农药残留的灵敏度和稳定性的基础和关键。常用的胆碱酯酶有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶(butylcholineesterase,BchE)。乙酰胆碱酯酶又称为真性或特异性胆碱酯酶,主要分布于动物的脑、脊髓和肌肉等组织中。丁酰胆碱酯酶又称为非特异性或拟胆碱酯酶,主要分布于动物的血清和肝脏中。乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶催化胆碱酯类底物水解的速率不同,对底物的种类具有不同程度的选择性。此外,植物中存在比较复杂的酯酶同工酶,其来源丰富、容易制备、成本低廉、保存方便,20世纪80年代开始被开发利用。植物源酯酶也属于非特异性酯酶,酶的活性通常不如动物源酯酶高。酶活性抑制法常用的是昆虫脑酯酶和血清酯酶,植物酯酶和肝脏酯酶应用较少。不同来源酯酶的主要特性见表6-l和表6-2。

酶活性抑制法常用酶源及酶的制备和保存方法如下。

(一)昆虫胆碱酯酶的制备

昆虫体内仅含有乙酰胆碱酯酶,主要分布在头部,其次为胸部。由于家蝇等昆虫的生活史短,可人工繁殖和饲养,故多以家蝇等昆虫为酶源。昆虫乙酰胆碱酯酶的提取方法(梁同庭,1990):取敏感家蝇或蜜蜂,在-20℃冷冻致死后装入塑料袋中,加入少许干冰振摇,硬化家蝇或蜜蜂的头部,使之与胸部断裂分开,收集头部,按0.24g/mL的量在pH7.5、0.1mol/L磷酸缓冲液中匀浆30s,匀浆液在4℃下以3500r/min离心5min。取上清液经双层纱布过滤,滤液经双层滤纸在布氏漏斗上抽滤,将滤液按每管1mL分装,使用时以pH 7.5的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释15倍。该酶液密封后于-20℃冰箱中保存3个月后未见酶活力下降。若将提取的酶液冷冻干燥,制成酶冻干粉,可以保存更长的时间,便于运输。

(二)动物血清酯酶的制备

动物血清中乙酰胆碱酯酶含量较高,来源比较广泛,如牛血清、马血清和鸡鸭等禽类动物血清等。将新鲜抽取的动物血清注入无抗凝剂的试管(15~25mL)中,封口后在37℃恒温箱内放置3h,使血细胞凝固,淡黄色血清慢慢渗出。用吸管将血清吸入离心管中,于4℃下以3000r/min离心5~10min,取上清液分装后在-20℃冷冻保存,使用时以蒸馏水稀释适当倍数。

(三)动物肝脏酯酶的制备

取动物(牛、猪、兔、鼠、鸡等)新鲜肝脏,去筋、膜、脂肪后切碎,按1份肝脏加3份蒸馏水(m/V)后匀浆,匀浆液在4℃下以2000~3000 r/min离心15~30min,上清液分装后在-20℃下储存备用,使用时以蒸馏水稀释5~20倍。实践表明,猪肝中提取的乙酰胆碱酯酶对农药的敏感性较强。

(四)植物源酯酶的制备

谷物是酯酶含量较高的酶源,小麦中酯酶活性比玉米、大米和小米高。提取方法:取新鲜食用小麦面粉置于具塞三角瓶中,按1∶5(m/m)比例加入蒸馏水,在振荡器上振荡30 min,于4℃下以5000r/min离心20min,上清液置4℃冰箱中保存,使用时加蒸馏水稀释。实践表明,植物酯酶活性抑制法测定农药的精确度和灵敏度不如动物胆碱酯酶活性抑制法好。

四、酶的纯化与保存

酶活性抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药,多采用乙酰胆碱酯酶的粗提液。酶的粗提液可采用处理过的羧甲基纤维素柱色谱净化[依照国家标准《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法》(GB/T 18630--2002)]。取10g羧甲基纤维素加100mL 0.5m01/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液混匀,浸泡15min后用布氏漏斗抽滤。水洗滤饼至中性后悬浮于100mL 1mol/L HCl-0.5mol/L NaCl溶液中混匀,静置15min,用布氏漏斗抽滤。水洗滤饼至中性后将滤饼悬浮于0.005 mol/L pH6.0的磷酸缓冲液中。将处理好的羧甲基纤维素悬浮液加入色谱柱,加入胆碱酯酶粗提液。在梯度混合器的初始液瓶中加150 mL 0.005 mol/L pH6.0的磷酸缓冲液,在梯度混合器的高浓度液瓶中加150 mL0.1 m01/L pH6.0的磷酸缓冲液,连接色谱柱,以2mL/min流速做梯度洗脱,收集后1/2流出液。

提取或净化后的酶液如果在一周内使用完毕,可在0~5℃下保存。多数情况下采用分装密封后200C冰箱中保存,保存时间最好不超过3个月。酶液反复冻融会显著降低酶的活性,所以酶液的冻融一般不能超过2次。如将酶液冷冻干燥,制成酶的冻干粉,4℃保存的有效期可达1年。

五、底物和显色剂

酶活性抑制法的显色反应可使用的酶的底物和显色剂很多,如乙酰胆碱(ACh)、乙酸萘酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物等均可作为酶的底物,根据所使用的酶的底物和显色机理的不同,显色反应大致可分为以下几种类型。

(一)乙酰胆碱一溴百里酚蓝显色法

溴百里酚蓝为pH指示剂,利用底物水解液酸碱性变化,通过pH指示剂显色。

溴百里酚蓝变色范围pH 6.2(黄色)→7.6(蓝色),在薄层色谱一酶抑制法中,板上含有农药的部位酶活性受抑制,不能水解生成乙酸,呈蓝色斑点;板上不含农药部位因为有乙酸产生,pH≤6.2,呈现黄色。

参考资料:农药残留分析

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