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酶活性抑制分析法(一)

2020-09-03 14:50:49 用户 周世红

经典的农药残留分析主要依靠色谱、色谱质谱联用等理化分析技术,需要训练有素的分析技术人员、专业化的实验室和仪器设备,分析样品的制备过程相对复杂,分析时间长、成本高,难以适应大量样品和现场样品快速检测的要求。为适应农副产品的产地源头监控、鲜活农副产品交易现场的快速检测和进出口农副产品的检测时效,需要研究开发快速高效的农药残留检测方法。随着生命科学、化学、医学、新材料等学科的发展和交融,分析化学从经典的物理化学分离分析发展到复杂体系中的分子识别,检测灵敏度已进入了单个分子的水平。以生物分析化学为基础的分析技术,如酶活性抑制分析、免疫分析、生物传感器等,以其简便快速、特异灵敏、样品用量少、成本低廉、不需要贵重仪器等优势,成为20世纪后期以来农药残留分析领域的一个重要发展方向。

应用酶活性抑制分析、酶联免疫吸附分析、金标免疫色谱、生物传感器、生物芯片等现代生物分析技术测定农药残留,对大量样本进行现场快速筛查定性分析和初步定量分析,必要时对初筛呈阳性或有疑问的样品再用色谱、波谱等经典的理化方法进行确证,可大大提高检测效率和降低检测成本。采用酶活性抑制分析、免疫分析等现代生物分析技术快速检测农药残留,提高其稳定性和准确度,并逐步使方法标准化,是国内外相关领域的科学工作者为之努力的目标和研究热点之一。

有机磷酸酯和氨基甲酸酯是两类重要的有机合成农药,一直是农副产品尤其是果蔬中农药残留的主要检测对象之一。果蔬是比较特殊的农产品,许多蔬菜(如叶菜)的生长和收获期短,生长季节病虫害防治引起的农药残留问题较多,成为农产品安全监控的重点。但蔬菜(特别是叶菜)的保鲜期很短,如采用常规色谱、波谱和色谱质谱联用法检测,没等检测完毕,蔬菜就已经失去了食用价值。因此用于快速检测蔬菜等农副产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶活性抑制技术及其产品被广泛研究和开发利用。

一、酶活性抑制分析法概述

Giang与Hall(1951)利用有机磷酸酯农药、Zweig和Archer(1958)利用氨基甲酸酯类农药在体外对乙酰胆碱酯酶(acetylcholine est。erase,AChE)具有抑制作用的原理,通过测定乙酰胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱产生乙酸的量(ApH)来衡量酶活性被抑制的程度,对敌敌畏、速灭磷、甲萘威等农药进行定量测定。Kramer与Gamsorl(1958)以乙酸胆碱的类似物靛酚乙酸酯作乙酰胆碱酯酶的底物,通过比色测定乙酰胆碱酯酶催化水解靛酚乙酸酯所产生的蓝色的靛酚的量,可检出1~10μg的多种有机磷和氨基甲酸酯类化合物,该方法成为后来采用比色法对有机磷氨基甲酸酯类农药进行测定的基础。1968年,Mendoza等将薄层色谱与酶活性抑制法相结合,通过在薄层板上分离和显色来测定10种有机磷和氨基甲酸酯类农药,最小检出量可达到ng水平,有较好的重现性,后来成为一种经典的有机磷和氨基甲酸酯类农药测定法被广泛采用。20世纪80年代,人们开始以来源丰富、取材和制备都十分方便的植物酯酶代替动物酶源,建立薄层色谱植物酯酶活性抑制分析法,为酶活性抑制分析法的进一步推广和应用开拓了新空间。20世纪90年代以来,国内外以酶活性抑制分析法为基础,先后开发出测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速测定试剂、速测卡和速测仪,酶活性抑制分析法仍然是我国目前现场快速检测蔬菜等农副产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的主要方法。

二、酶活性抑制分析法原理

有机磷和氨基甲酸酯类农药都是神经毒剂,对昆虫、哺乳动物(包括人体)神经传递过程中具有重要作用的乙酰胆碱酯酶具有强烈的抑制作用。当乙酰胆碱酯酶活性被抑制时,该酶对在神经传导过程中起重要作用的乙酰胆碱的水解不能正常进行,从而导致酶的底物乙酰胆碱的积累,影响动物正常的神经传导,引起神经中毒甚至导致死亡。酶活性抑制法快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留就是利用这一神经毒理学原理来实现的。当被测样品提取液中不含或含有很少量的有机磷或氨基甲酸酯类农药时,乙酰胆碱酯酶的活性就不被抑制或仅被轻微抑制,酶的底物乙酰胆碱就能够被水解或大部分被水解,水解产物与加人体系中的显色剂反应产生有色物质,可通过比色法进行测定。如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药,酶的活性就会受到抑制或部分抑制,试样中加入的酶的底物就不能被酶水解或部分水解,从而不显色或显色很浅,用分光光度计测定吸光度值,以不含有机磷或氨基甲酸酯类的农药为对照,计算酶活性被抑制的百分率。抑制百分率与有机磷或氨基甲酸酯类农药的浓度在一定范围内呈正比,据此对有机磷或氨基甲酸酯类农药进行定性测定和定量测定。

羧酸酯酶(非特异性酯酶的一种)与乙酰胆碱酯酶类似,均以丝氨酸残基作为活性中心,因此对乙酰胆碱酯酶有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药对羧酸酯酶也有抑制作用,因此依据有机磷和氨基甲酸酯类农药对羧酸酯酶活性抑制作用的有无或大小,也可以对有机磷或氨基甲酸酯类农药进行定性测定和定量测定。

酶活性抑制法检测有机磷或氨基甲酸酯类农药的基本原理见图6—1。

近年来,商品化酶活性抑制法检测产品(如酶片、酶标签、速测箱等)大多是建立在上述显色反应基础上的,但是除了有机磷和氨基甲酸酯类物质有可能对乙酰胆碱酯酶活性产生抑制作用外,某些氯代烟碱类似物对乙酰胆碱酯酶也有一定的抑制作用,因此检测过程中需要注意由此引起的假阳性现象。

参考资料:农药残留分析

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